Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
- самописца и походящего интегратора или компьютера.
Описание процесса ввода пробы и его автоматизация являются критическими факторами для точного количественного анализа. Ввод пробы может быть основан на использовании силы тяжести, давления, вакуума и электрокинетических сил. Количество каждого компонента образца, введённого электрокинетически, зависит от его электрокинетической подвижности, что приводит к возможным неравным условиям для разных веществ при использовании данного режима ввода пробы.
Используют капилляр, буферные растворы, способ пробоподготовки и создания условий анализа, раствор пробы и условия миграции, указанные в частной статье для исследуемого вещества. Применяемый раствор электролита фильтруют для удаления твёрдых частиц и дегазируют для предотвращения образования пузырьков, мешающих работе детектора и созданию электрического контакта в капилляре во время процесса разделения. Для обеспечения воспроизводимых значений времени миграции веществ для каждой аналитической методики должна быть разработана методика тщательной промывки системы.
КАПИЛЛЯРНЫЙ ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРИНЦИП
В капиллярном зонном электрофорезе аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор без антиконвективной среды. В данном методе разделение происходит вследствие того, что различные компоненты образца мигрируют с различной скоростью в виде отдельных полос. Скорость перемещения каждой полосы зависит от электрофоретической подвижности вещества и электроосмотического потока в капилляре (см. Общие принципы). Для
улучшения разделения веществ, адсорбирующихся на кварцевой поверхности, могут быть использованы капилляры с модифицированной поверхностью.
При использовании данной разновидности капиллярного электрофореза может быть осуществлён анализ как малых (Mr < 2000), так и больших молекул (2000 < Mr < 100 000). Благодаря высокой эффективности капиллярного электрофореза в свободном растворе может быть проведено разделение молекул, имеющих очень незначительные различия в величинах отношений заряда к массе. При добавлении к разделяющему буферному раствору хиральных селекторов данный способ разделения позволят разделять хиральные соединения.
ОПТИМИЗАЦИЯ
Оптимизация разделения является комплексным процессом, в котором основную роль могут играть несколько параметров разделения. Основными факторами, которые следует принимать во внимание при разработке методик разделения, являются инструментальные параметры, а также параметры раствора электролита.
Инструментальные параметры
Напряжение. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, повышение температуры и, как результат, образование градиентов вязкости в буферном растворе, находящемся в капилляре. Данный эффект приводит к расширению полосы и уменьшению разрешения.
Полярность. Полярность электродов может быть нормальной (анод на входе и катод на выходе), электроосмотический поток при этом перемещается по направлению к катоду. В случае обращённой полярности электродов электроосмотический поток направлен от выхода из капилляра и только заряженные аналиты с электрофоретическими подвижностями превышающими величину электрофоретического потока попадают к выходу.
Температура. Температура влияет, главным образом, на вязкость и электрическую проводимость и, как следствие, на скорость миграции. В некоторых случаях увеличение температуры капилляра может вызвать конформационные изменения в молекулах белков, что изменяет их времена миграции и эффективность разделения.
Капилляр. Размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на время анализа, эффективность разделения и загрузочную ёмкость. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может ослабить электрическое поле (в случае работы при постоянном напряжении), что приводит к увеличению времени миграции. Для определённого буферного раствора и электрического поля тепловая конвекция и, следовательно, расширение полос образца зависит от величины внутреннего диаметра капилляра. Последняя также влияет на предел обнаружения, зависящий от объёма введённой пробы и применяемого детектора.
Поскольку адсорбция компонентов образца на стенке капилляра влияет на эффективность, при разработке методики разделения должны быть предложены способы предотвращения таких взаимодействий. В некоторых случаях, касающихся белков, были предложены способы, позволяющие избежать адсорбции на стенке капилляра. Некоторые из таких способов (использование экстремальных рН и адсорбция положительно заряженных буферных добавок) для предотвращения адсорбции белков требуют лишь изменения состава буферной смеси. В других способах внутренняя стенка капилляра покрывается полимером, ковалентно
связанным с поверхностью, что предотвращает взаимодействия между белками и отрицательно заряженной поверхностью кварца. Для этих целей выпускаются готовые к использованию капилляры с покрытиями, состоящими из нейтральных гидрофильных, катионных или анионных полимеров.
